Ein wesentliches Ziel unseres Immunmonitoring-Programms besteht in der Integration eines umfassenden multidimensionalen Immunprofils in klinische Studien für Tumorpatienten, um Biomarker für das Ansprechen auf die Behandlung zu identifizieren, therapiebedingte Nebenwirkungen zu reduzieren, der Behandlungsmethode zugrunde liegende Mechanismen zu entdecken sowie Wege der Behandlungsresistenz zu identifizieren. Die daraus gewonnenen Erkenntnisse können zum Design verbesserter immuntherapeutischer Strategien für Tumorpatienten beitragen. Derzeit führen wir ein Immunmonitoring für verschiedene präklinische und klinische Studien durch, an denen Patienten mit kolorektalem Karzinom, Pankreaskarzinom, hepatozellulärem und cholangiozellulärem Karzinom, Melanom, akuter myeloischer Leukämie und myelodysplastischem Syndrom teilnehmen.

• Umfassende Analyse von Frequenz, Phänotyp und funktionellen Eigenschaften verschiedener Immunzellpopulationen (Dendritische Zellen, T-Zellen, NK-Zellen, Monozyten/Makrophagen, B-Zellen) in Blut, Knochenmark und Tumorgeweben von Patienten mittels Multiparameter-Durchflusszytometrie, FACS-basierter Einzelzellsortierung und Transkriptom-Analysen.
• Evaluierung von Frequenz, Phänotyp und funktionellen Eigenschaften Peptid-spezifischer und Tumor-reaktiver T-Zellen unter Verwendung von Durchflusszytometrie, ELISA, ELISpot, Radioaktivitätstests (Cr51/3H-Thymidin), Klonierung und TCR-Sequenzierung.
• Analyse der Zusammensetzung und räumlichen Verteilung verschiedener Immunzellpopulationen innerhalb von Knochenmark- und Tumor-Gewebeproben. Dazu werden immunhistochemische und Immunfluoreszenz-basierte Multiplex-Färbungen unter Verwendung der automatisierten quantitativen Pathologie-Bildgebungsplattform Vectra durchgeführt und analysiert.
• Nachweis und Quantifizierung multipler proinflammatorischer Zytokine und Chemokine sowie löslicher Checkpoint-Moleküle in Seren von Tumorpatienten mithilfe der LuminexTM-Technologie.

Um die Komplexität und Heterogenität der verschiedenen Immunzelluntergruppen die das Tumorwachstum und das Ansprechen auf die Behandlung bei Patienten mit Krebs beeinflussen, zu entschlüsseln, haben wir im Rahmen des Frankfurt Cancer Institute (FCI) und des DKTK die Immunmonitoring-Plattform (IMP) ins Leben gerufen, in der sich Experten am Standort zusammengeschlossen haben. Unser Ziel ist es, die von den Mitgliedern der Initiative entwickelten state-of-the-art Immunmonitoring-Techniken den Forschenden des FCI und DKTK zur Verfügung zu stellen. 

Technologien:

Durchflusszytometrie und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS)

FACS-Protokolle ermöglichen die Isolierung von Immunzell-Subpopulationen aus menschlichem Gewebe.

Fokussierte und klinisch validierte Multicolor-Panels zur Untersuchung von menschlichen und murinen Immunzellen in jedem Entwicklungsstadium.

Explorative Panels (12-35 Marker) für das Immunoprofiling von Blut und peripheren Geweben.

Quantitative räumliche Informationen über PhenOptics (AKOYA BIOSCIENCES)´

PhenOptics-Workflow: Nach der Aufnahme und Vorbereitung der Gewebeproben werden die Schnitte mit automatisierten Systemen (LUNAPHORE LabSat Research Stainer oder BOND RX Automated IHC Research Stainer) gefärbt (7-9 fach). Multispektrale Bilder werden mit dem Vectra Polaris Automated Quantitative Pathology System generiert und mittels inForm Tissue Finder und HALO Image Analysis Software bioinformatisch ausgewertet, um phänotypische und räumliche Daten zu erhalten.

Immunzell-Multiomics bei Einzelzellauflösung (BD Rhapsody)

Einzelzell-MultiOmics-Workflow: Das BD Rhapsody System kombiniert auf einzigartige Weise die Analyse von Genexpression und Oberflächenproteinexpression auf Einzelzellebene. Komplexe heterogene Zellzusammensetzungen einschließlich Immunzell-Subpopulationen in Gewebe oder Blut werden mit höchstmöglicher Präzision aufgelöst.

Das IMP wird von Karl H. Plate, dem Direktor des Edinger Instituts, geleitet. Seine Mitglieder bieten eine Reihe von hochmodernen immun-zentrierten Assays an, teilen ihre Expertise in der Versuchsplanung und helfen bei der Zuordnung der am besten geeigneten Technologien für die gewünschten wissenschaftlichen Fragestellungen.

Bitte kontaktieren Sie uns bezüglich Ihrer zukünftigen Experimente:

Karl H. Plate (Leitung)

Yvonne Reiss - PhenOptics

Andreas Weigert - FACS, PhenOptics

Michael Rieger - FACS, Einzelzellsequenzierung

Evelyn Ullrich - FACS

Jonathan Schupp - Staff Scientist

Die DKFZ/NCT Immunmonitoring Einheit besteht seit 2015 und hat seitdem zahlreiche klinische Studien mit insgesamt über 700 Patienten betreut.

Aktuell führen wir Blut- und Gewebebasiertes Immunmonitoring für 14 klinische Studien durch, darunter viele innovative Phase I Studien von viele Heidelberger Wissenschaftlern, aber auch Phase I und II Studien mit externen Sponsoren. Die Studien umfassen Patienten mit Hirn-, Lungen-, Speiseröhren-, Darm-, Brust- und Hautkrebs, die mit immunmodulatorischen Antikörpern, Impfstoffen, Strahlentherapie oder zellulären Infusionsprodukten behandelt werden.

Unser Methodenspektrum entwickelt sich fortwährend. Unser Anspruch ist es dabei, individuelle immunologische Analysen auf dem neuesten Stand der Wissenschaft anzubieten. Gleichzeitig verfügen wir über ein Qualitätsmanagementsystem und können GMP- und GCLP-konforme Messungen durchführen.

Unser Verständnis des Immunsystem wird aktuell durch technologische Innovationen rasch vorangetrieben. Vorbei sind die Zeiten, als nur vorausgewählte Parameter auf Populationsebene gemessen wurden. Hochauflösende Verfahren ermöglichen es uns heute, Immunzellrezeptoren, funktionelle Parameter, Zellzustand und Evolution genau zu untersuchen:

• Hochparametrische Durchflusszytometrie (BD FACS Lyric, 12 Fluoreszenzparameter) von phänotypischen und funktionellen Zelleigenschaften liefert uns grundlegende Informationen über die zelluläre Zusammensetzung von Blut- und Gewebeproben. Wir etablieren aktuell höher dimensionierte Messungen frischer Proben, damit ein Großteil der Zellen für nachfolgende Analysen erhalten bleibt.
• Immunzellreaktivität und Antigenspezifität werden mittels ELIspot, ELISA, Luminex, sowie durchflusszytometrischen und Sequenzierungs-basierten Analysen gemessen. So charakterisieren wir z.B. Zytokinproduktion, die Häufigkeit von Antigenreaktiven Zellen und/oder die Immunrezeptoren, welche für die Antigenerkennung verantwortlich sind.
• T-Zell Rezeptor (TZR) Sequenzierung und Entschlüsselung: Die Analyse von Immunrezeptor-Repertoires ist eine neue Technologie, die uns hilft Immunantworten zu verfolgen und zu verstehen. Wir benutzen ein kommerzielles Kit (ImmunoSeq) um das TZR (beta) Repertoire zu untersuchen und unterstützen damit gerne DKTK Partner, die Interesse an Immunrepertoireanalysen haben. Die Sequenzierungen werden von der DKFZ Hochdurchsatz-Sequenziereinheit durchgeführt.
• Die Verfügbarkeit von Hochdurchsatz Einzelzellsequenzierung erlaubt einen Quantensprung im Immunemontoring: Selbst in extrem diversen Immunzellpopulationen können wir nun die Funktionalität einzelner Zellen untersuchen und gleichzeitig ihren Antigen-spezifischen Rezeptor identifizieren. Wir verwenden dabei die 10x Technologie, um Informationen über TZR, Transkriptom und/oder Proteom von bis zu 10.000 Einzelzellen pro Probe zu erhalten.
• Die strategische Kombination von funktionellen Messungen mit Next-Generation-Sequenzierungs-basierten Ansätzen in Blut, Gewebe, expandierten T-Zellen oder Tumor-infiltrierenden Lymphozyten ermöglicht uns die rasche Entschlüsselung von potentiell Tumor-reaktiven Rezeptoren, welche kloniert und in vitro auf ihre Funktionalität geprüft werden können.

Die DKTK Abteilung für Translationale Hautkrebsforschung (Translational Skin Cancer Research, TSCR) am Partnerstandort Essen wurde 2014 gegründet und führt molekularbiologische und immunologische Untersuchungen an Probenmaterial von HautkrebspatientInnen durch.

Der Fokus liegt in der Charakterisierung immunologischer Prozesse der Tumorerkennung und -abwehr. Hierbei untersuchen wir sowohl Blut- als auch Gewebeproben. Die entsprechenden Analysen erfolgen sowohl an retrospektiven Kohorten, als auch im Rahmen prospektiver klinischer Studien. 

Eine Auswahl der bisher translational begleiteten klinischen Studien:

• IMMOMEC: IMmune MOdulating strategies for treatment of MErkel cell Carcinoma; im Rahmen des 7. Framework Programme der EU
• IMMUNED: Nivolumab versus Nivolumab/Ipilimumab versus Placebo für Patienten mit Stadium IV Melanom ohne Krankheitszeichen; Investigator-Initiated Trial (IIT) der Arbeitsgemeinschaft dermatologische Onkologie (ADO)
• ADMEC-O: Nivolumab versus Observation in Merkel Cell Carcinoma; IIT der ADO
• AliCe: Avelumab mit Cetuximab; Interventional Study für das nicht operativ behandelbare Stadium III und IV des kutanen Plattenepithelkarzinoms; IIT der ADO
• BoneMet: PD-1 Immuncheckpointblockade in Kombination mit Denosumab bei Patienten im Stadium IV Melanom mit Knochenmetastasen; IIT der ADO
• MCC TRIM: Non-Interventional Study (NIS) zum Merkelzellkarzinom im Rahmen des prospektiven Hautkrebsregisters ADOREG

Für unsere molekularen Analysen setzen wir hoch innovative Methoden und Technologien ein. Multi-geplexte, hochauflösende Techniken, z.T. als Hochdurchsatzverfahren, erlauben auch kleinste Details trotz oft  kleiner Probenmenge exakt zu detektieren und zu quantifizieren. 

Unser aktuelles Methodenspektrum umfasst unter anderem:

• Single Cell RNA Sequencing: Durch neue multiplexe Technologien (10xGenomics) wird das Expressionsprofil einzelner Zellen einer frischen Tumorgewebeprobe aufgeschlüsselt. Dies ermöglicht eine exakte Wiedergabe der zellulären Zusammensetzung der Tumorgewebeprobe, inklusive der Funktionalitäten und Differenzierung der einzelnen Zellen.
• T-Zell-Rezeptor-Sequenzierung: Mittels ImmunoSeq wird das T-Zell-Rezeptor‑Repertoire entschlüsselt und die Dynamik von Immunantworten in Hauttumoren verfolgt. Durch Anwendung von Algorithmen wie „GLIPH“ (Grouping of Lymphocyte Interactions by Paratope Hotspots) wird die Komplexität der Antigen-Spezifität der T‑Zell-Rezeptoren untersucht. Diese Untersuchungen werden z.T. auch mit Single Cell VDJ/RNA Seq Data kombiniert.
• NanoString (Genexpressionsanalyse): Die Analyse von immunrelevanten und tumorassoziierten Prozessen auf Genexpressionsebene wird auch bei „low quality“ Tumorgewebeproben (FFPE) durch diese Technologie ermöglicht.
• Multiplexe Immunfluoreszenzfärbung: Differenzierung des Tumormikromilieus in histologischen Tumorschnitten mittels simultaner 7-facher Immunfärbung. Ein Spektrum an aufeinander abgestimmter Antikörpersets für das Tumorimmuninfiltrat und Stromazellen ist etabliert.

Der wissenschaftliche Fokus der Arbeitsgruppe Immunmonitoring, Teil der Abteilung Immunologie an der Universität Tübingen, liegt in der Untersuchung von adaptiven Immunantworten in Krebspatienten. T-Zell-Populationen werden hierfür aus Blut oder Tumorgeweben von Patienten gewonnen und auf phänotypischer, wie auch auf funktioneller Ebene untersucht. Unsere Expertise liegt im Besonderen in der Untersuchung von Antigen-spezifischen T-Zell Antworten während der Immuntherapie, wie z.B. bei der personalisierten Multi-Peptid-Vakzinierung. Des Weiteren untersuchen wir verschiedene andere Immunzellpopulationen, welche fähig sind mit dem Tumor zu interagieren.

Wir sind zudem Gründungsmitglied und Mitorganisator des „Cancer Immunotherapy Immunoguiding Program (CIP/CIMT)“, welches 2005 gegründet wurde. Das Ziel dieser internationalen Arbeitsgruppe ist zu der Verbesserung von Vergleichbarkeiten und zugleich der Sensitivitäten von etablierten immunologischen Techniken beizutragen, sowie die Entwicklung von ergänzenden Methoden voranzutreiben, um dadurch Fortschritte in dem Feld der Immuntherapie und deren Auswertung zu erzielen.

Methoden und Technologien

• Multiparametrische Durchflusszytometrie
• ELISpot
• Bead-basierte Zytokinmessungen
• Cytotoxizitätsassays (VITAL, XCelligence, …)
• T-Zell-Priming, -Kultur (auch TILs), -Sortierung und -Klonierung
• Untersuchungen antigen-spezifische CD4 und CD8 T-Zellen 

Monitoring - Aktivitäten (In Kooperation mit verschiedenen nationalen und internationalen Kooperationspartnern):

• Charakterisierung von T-Zellepitopen aus neuidentifizierten Tumor-assoziierten Antigenen
• Auswirkung von Standardtherapien auf das Immunsystem von Krebspatienten
• Immunmonitoring von Peptid-basierten Vakzinierungsstudien 
• Entwicklung neuer Adjuvanzien
• Assay-Entwicklung: Etablierung, Optimierung, Standardisierung und Validierung von Immunoassays

Bildquelle: Blausen.com staff (2014) "Medical gallery of Blausen Medical 2014". WikiJournal of Medicine 1 (2).DOI:10.15347/wjm/2014.010. ISSN 2002-4436