Prof. Kirsten Lauber von der Arbeitsgruppe Molekulare Radioonkologie der Klinik für Radioonkologie am LMU Klinikum (München) stellte den Fellows der DKTK School of Oncology einen Vergleich verschiedener Assay-Formate zur Analyse des klonogenen Wachstums in vitro vor. In diesem Beitrag im Rahmen der Online-Seminarserie zu Techniken in der translationalen Forschung am 22. November hörten die Fellows gespannt der Präsentation von Assay-Formaten zu, die bereits vor mehr als 100 Jahren entwickelt, danach weiterentwickelt und ins 21. Jahrhundert übertragen wurden, um sie für komplexere Zellkulturmodelle und Hochdurchsatz-Probenahmen anwendbar zu machen. Ausgehend von einem 2D-Zellwachstumsprotokoll von Greenwood&Yule aus dem Jahr 1917 und Puck&Marcus aus dem Jahr 1955, das 1989 und 2006 aktualisiert wurde, wurde die neueste Version des Protokolls von Lauber und Kollegen mit einem verbesserten mathematischen Analysealgorithmus versehen und für 3D-Organoid- und Sphäroid-Kulturen angepasst: Brix et al. 2021.

Mit einem solchen klonogenen Assay wird die Fähigkeit einer einzelnen Zelle analysiert, Kolonien in vitro zu bilden: Es werden nur proliferierende Zellen gemessen, die in der Lage sind mindestens sechs Zellteilungen zu durchlaufen, aus denen mehr als 50 Tochterzellen hervorgehen. Die Bewertung von solchen Assays erfolgt durch Auszählung der Kolonien nach dem Aussäen einer begrenzten Anzahl von Zellen einer Einzelzellsuspension. In ähnlicher Weise, jedoch mit einer anderen mathematischen Grundlage, misst der Assay zur Grenzwert-Verdünnung das klonogene Wachstum, indem er den Anteil der fehlgeschlagenen Koloniebildung bei seriellen Verdünnungen einer einzelnen Zellsuspension bestimmt. Die Auswertung der Ergebnisse ist binär, da nur zwischen Schalen mit oder ohne klonogenem Wachstum unterschieden wird.

Historisch betrachtet wurde der klonogene Assay vor allem für den Einsatz in der Strahlenbiologie, Chemie und Toxikologie für Dosis-Wirkungs-Analysen (z. B. kombinierte Behandlungsreaktionen) entwickelt und wird hier nach wie vor eingesetzt, während der Assay zur Grenzwert-Verdünnung damals wie heute vorwiegend in der Hämatologie, Virologie und Immunologie verwendet wird, oft gefolgt von einer weiterführenden Charakterisierung der koloniebildenden Zellen.

Die Publikation von Brix et al. 2021 präsentiert den klonogenen Assay in einem überarbeiteten, modularen Rahmenprotokoll, einschließlich des mathematischen Analysetools CFAcoop (R-Paket und Excel-Vorlage). 

Die Tech Talks für Fellows der School of Oncology werden im Jahr 2023 fortgesetzt. 

Anna Vetter, Wissenschaftliche Koordinatorin DKTK München